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肝脏是药物代谢的重要器官，体外代谢模型多以肝脏为基础。其中，原代肝细胞作为一种肝脏体外模型，因具有较好的体外试验重现性，基本维持了肝脏的代谢功能，特别是较好的保留了与体内一致的酶水平，成为了体外药物试验的“金标准”，广泛应用于药物代谢与毒理学等研究中。原代肝细胞分离常用的方法有直接剪切法、组织块培养法和两步胶原酶灌流法等。其中，两步胶原酶灌流法因其对肝细胞损伤作用较小，肝细胞产率和存活率高，成为了分离原代肝细胞的经典方法。

原代肝细胞及其应用

原代肝细胞(Primary hepatocytes)是指从动物肝脏直接分离的肝实质细胞，是高度分化的细胞，具有丰富的酶系及多种特异性功能。原代肝细胞作为一种体外模型，具有其它体外模型不可替代的优点：

①与体内环境保持一致，酶量和辅助因子水平都是正常的生理浓度，可以在接近生理状态的的情况下研究药物的代谢和毒性；

②较好保留和维持了肝细胞的完整形态和肝细胞体外代谢活性，真实反应了体内的代谢情况；

③无须担心动物实验的伦理问题，亦可减少动物实验所需要的的成本开支，实现了减少（Reduction）、替代（Replacement）、优化（Refinement）的3R伦理原则。

  原代肝细胞作为体外药物试验的“金标准”，广泛应用于药物代谢与毒理学等研究中：

  探讨药物在肝中的代谢途径和药物药代动力学的研究；

  评价药物和外源性物质对肝脏中细胞色素P450酶诱导作用并探讨其诱导机制；

  预测和解释药物与药物之间的相互作用；

  研究药物的细胞毒性等。

原代肝细胞分离

原代肝细胞的分离是肝细胞体外实验的重要基础和关键步骤，如何获得高活力、数量多的肝细胞，分离技术是关键的第一步。目前，原代肝细胞的分离方法有直接剪切法、组织块培养法、胰蛋白酶离体消化法、两步胶原酶灌流法（Seglen灌流法）等。

【直接剪切法】

原理：用手术剪或锋利的刀片将肝脏切成小块，然后用胶原酶或胰蛋白酶进行消化，分离得到肝细胞。

优点：操作简单，适用于大量细胞的分离。

缺点：细胞损伤较大，纯度较低。

【组织块培养法】

原理：将肝脏组织切成小块，在培养皿中加入含有特定生长因子的培养液进行培养，使组织块贴壁生长，肝细胞逐渐从组织块中游离出来。

优点：能够保持细胞的天然状态，适用于长期培养。

缺点：肝细胞密度不易掌控且组织块能否游离出肝细胞无法确定。

【胰蛋白酶消化法】

原理：用胰蛋白酶或胰酶对肝脏进行消化，分离得到肝细胞。

优点：能够较为彻-底地分解细胞间物质，获得较纯的肝细胞。

缺点：胰蛋白酶的价格较贵，成本较高。

【两步胶原酶灌流法（Seglen灌流法）】

原理：用含有胶原酶的溶液通过门静脉灌注到肝脏中，使肝实质细胞与间质分开，然后收集分离出的肝实质细胞。

优点：能够分离出存活率高、形态好的肝细胞，适用于长期培养。

缺点：操作较为繁琐，技术要求高，成本也相对较高。

其中，两步胶原酶灌流法（Seglen灌流法）是Seglen于1976年在前人的基础上改良形成的，它具有分离效果好，细胞产率高，存活率高，对细胞损伤小，细胞维持肝细胞特异性功能时间长等特点，是目前国际上流行的原代肝细胞分离方法。

两步胶原酶灌注法先使用无钙灌注液灌注，无钙灌注液作为预灌液，可以将肝脏内的残留血液灌注出，除去或者减少细胞间的钙离子，以减少细胞间的粘着力。之后再使用含胶原酶灌注液进行灌注把组织中的细胞释放出来。胶原酶在消化肝组织的同时解除了细胞间接触抑制或活化了潜在的蛋白激酶、生长因子或受体，使肝细胞能逐渐适应消化分离过程中所发生的细胞、外环境及细胞的各种改变，这些改变对离体肝细胞修复、生长及功能有重要的促进作用，有利于肝细胞的培养。

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